20 septiembre 2013

Un carbeno es una especie singular en Química Orgánica. Cuando se estudia la Química General y la Orgánica en particular siempre se menciona el famoso octeto de estabilidad. Es decir que el átomo está rodeado de 8 electrones en su ultima capa electrónica. Esto ya fue enunciado en 1917 por el gran Gilbert N. Lewis. A esta norma no escapa ni el carbono. O sí… Aquí es donde entra el carbeno, un átomo de carbono con solo 6 electrones y sin carga.

¿A efectos prácticos que significa esto? Que es una especie altamente reactiva y que, por lógica, esta deseosa de atrapar otro par de electrones para completar los 8. En Química a estas especies ansiosas de ir a por electrones los llamamos electrófilos.

Carbeno más sencillo

Sin embargo la particularidad de esta especies no terminan aquí. En determinadas circunstancias estos compuestos pueden tener cierta estabilidad e incluso ser medianamente estables. Uno de los primeros hitos contrastados en esta dirección fue la caracterización del carbeno de Arduengo en 1991. Las características electrónicas y el volumen de los sustituyentes que tiene al lado nuestro especial carbono, hacen de él algo más que efímero. Además este hecho permitió abrir el melón de algo bastante más importante como la preparación de determinados catalizadores para realizar unas reacciones llamadas de metátesis. Por estos catalizadores y sus correspondientes reacciones, que sirven tanto para crear nuevos materiales como para conseguir fármacos, Robert Grubbs recibió en 2005 el premio Nobel de Química junto con Richard Schrock y Yves Chauvin. 

Carbeno de Arduengo

Con todo lo que comentado hasta ahora podríamos pensar en que un carbeno es una especie sintética, hecha por el hombre y como tal vez diría Punset, nada natural. Y aquí es donde empieza su intervención el compuesto que da título al post, la vitamina B1. La vitamina B1 o tiamina es una compleja molécula fundamental como catalizador en diversos procesos del cuerpo humano. Con una pequeña modificación química participa decisivamente en la obtención del acetil-CoA, la molécula-gasolina de nuestro cuerpo. También participa en las últimas etapas de la fermentación alcohólica. El mecanismo es complicado y excelente para enseñar Química Orgánica. Ya en 1957 el gran químico Ronald Breslow postulo un posible intermedio carbeno a partir de la tiamina. Además, utilizó con éxito la tiamina como catalizador en reacciones química sencillas. Sin embargo, la formación de especies de carbeno estables sobre las enzimas parecía ser una perspectiva poco probable por su inestabilidad en medios fisiológicos.

Vitamina B1 o tiamina

En una reciente y excelente trabajo publicado en Nature Chemical Biology (http://www.nature.com/nchembio/journal/v9/n8/full/nchembio.1275.html) el profesor Tittmann y colaboradores han realizado un gran paso en la comprensión del mecanismo de catálisis de la tiamina. En la publicación nos presentan los datos espectroscópicos y estructurales de la tiamina unida a la correspondiente enzima en un complejo no covalente con el sustrato que va a catalizar. Esos datos implican la existencia de un carbeno estable. El título del articulo no puede ser más revelador: “Observation of a stable carbene at the active site of a thiamin enzyme” Las figuras que presentan son simplemente increíbles.

Propiedades geométricas del carbeno asociado al enzima http://www.nature.com/nchembio/journal/v9/n8/fig_tab/nchembio.1275_F3.html

Un carbeno, aquella especie altamente inestable, que más parece el resultado de la labor “diabólica” de los químicos que un producto de origen natural, esta presente todos los días, a todas horas, en el interior del cuerpo humano. Fascinante.

Este post participa en el XXVII Carnaval de Química, que se aloja en el blog Educación Química de Bernardo Herradón @QuimicaSociedad 

Posted on viernes, septiembre 20, 2013 by Héctor Busto

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15 septiembre 2013

Después del primer post de este Blog sobre el empleo de la Resonancia Magnética Nuclear (RMN) en el estudio del proceso de vinificación hoy toca volver al tema. En ese primer post, en uno de sus últimos puntos, comentaba la importancia del seguimiento metabólico de los aminoácidos en las dos fermentaciones que sufre el vino, la fermentación alcohólica y la fermentación maloláctica. Fundamentalmente, los aminoácidos, en la fermentación alcohólica, que recordemos es la que primero se produce, pueden transformarse en alcoholes superiores (con más átomos de carbono que el etanol) e influyen decisivamente en el perfil aromático del vino. El mecanismo por el cuál sufren esta transformación se denomina mecanismo de Erlich (en honor a Paul Erlich). En el trabajo previo observamos como la totalidad del aminoácido se transformaba en el correspondiente alcohol en los primeros instantes de la fermentación alcohólica. Del aminoácido inicial no quedaba ni rastro. Evidentemente seguía habiendo el vino aminoácidos, pero estos ya no procedían de la uva sino, probablemente de la ruptura de las propias levaduras.

¿Cuál era nuestro método para observar este hecho? Nuestra querida RMN. En esta ocasión la RMN de 13C. Es decir, observamos los átomos carbono de los compuestos. Y además hacemos de la debilidad una fortaleza. ¿Por qué digo esto? Porque el isótopo más abundante del carbono es el 12 (núcleo atómico con 6 protones y 6 neutrones) y para nuestra desgracia, éste no es observable por RMN. Hay otro isótopo, también natural y estable que es el 13 (6 protones y 7 neutrones) y sí es observable por RMN. Nuevamente otro inconveniente, solo está presente en 1.1%. ¿Y por qué estos inconvenientes se vuelven en fortaleza? Si nosotros tenemos a disposición compuestos en los que el porcentaje de carbono 13 es cercano al 100% seremos capaces de distinguir ese compuesto (marcado con carbono 13) de los compuestos que tienen mayoritariamente carbono 12 (no marcados). Y lo que es más importante, podremos ver, en un sistema vivo, como evoluciona ese compuesto y que otros metabolitos genera. ¿Se entiende? Está ha sido y es una herramienta imprescindible para detallar multitud de procesos metabólicos (conjunto de reacciones químicas en los seres vivos) y descubrir sus transformaciones.

Con esta herramienta decidimos realizar el estudio metabólico de un aminoácido importante en la elaboración del vino; la histidina. Sobre el metabolismo de este aminoácido y uno de sus metabolitos, la histamina, escribió recientemente Ununcuadio en el blog Hablando de Ciencia.

Estructura de la histamina

La histamina es una amina biógena que está involucrada en numerosos procesos en nuestro cuerpo, como por ejemplo en procesos del sistema inmune. Por tanto estamos hablando de un compuesto que tenemos en el cuerpo. Sin embargo, parece que en altas concentraciones, o más concretamente en concentraciones superiores a las que se localizan en nuestro interior, la histamina genera efectos adversos. En el vino la histamina suele estar presente en cantidades muy pequeñas. Un exceso de histamina en el vino se relaciona con el efecto “resaca” y dolor de cabeza que produce la ingesta del mismo. Este hecho ha sido empleado por algunos países para controlar los niveles de histamina en los vinos que quieren entrar en su mercado, niveles que van desde los 8 mg/L a los 20 mg/L. Bien sea por seguridad, bien sea por poner dificultades a la exportación de vinos de otros países, está claro que los niveles de histamina resultan un parámetro muy importante en el negocio del vino.


Como he comentado antes la histamina procede del catabolismo del aminoácido histidina. Pero, ¿En que etapa del proceso de vinificación se produce? ¿es importante controlar el nivel de histidina en la uva? ¿se puede minimizar la concentración de histamina en función de las prácticas enológicas?

Al emplear histidina marcada (con ese isótopo de carbono 13 que he comentado antes) podemos saber cual es la transformación que sufre en cada etapa de la vinificación. De esta forma hemos observado que:

La histidina en la fermentación alcohólica solo genera el alcohol correspondiente (histaminol). Este proceso se realiza en las primeras etapas de la fermentación y no se observa nada de la “malvada” histamina.

Transformación de histidina en histaminol


Cuando lo que controlamos es la fermentación maloláctica, realizada con las bacterias presentes en las propias bodegas (autóctonas) sí que observamos la generación de histamina a partir de la histidina. No observamos ningún otro compuesto más que la amina biógena y ésta se produce junto con la transformación del ácido málico en ácido láctico.

Transformación de histidina en histamina


Sin embargo cuando realizamos el mismo estudio con bacterias comerciales especificas los niveles de histidina marcada se mantienen totalmente estables. No se observa nada de la temida histamina ni ningún otro metabolito derivado de la histidina.

Por tanto del trabajo podemos desarrollar varias conclusiones. Los niveles del aminoácido histidina en la uva no afectaran a los futuros niveles de histamina en el vino. Si la fermentación alcohólica se produce eficazmente toda la histidina pasará a histaminol. Y tal vez más importante, el paso clave es la fermentación maloláctica. Su control es vital para regular los niveles de histamina y el empleo de las bacterias adecuadas harán que estos niveles sean mínimos.

Este trabajo ha sido recientemente publicado en la revista Journal Agricultural and Food Chemistry editada por la American Chemical Society. Forma parte de la Tesis doctoral de Eva López Rituerto. Dicha tesis ha merecido un premio a la mejor Tesis en RMN otorgado por el Grupo Especializado de la Real Sociedad Española de Química.


Los post escritos sobre la aplicaciones de la RMN en el mundo de la Enología muestran solo la punta del iceberg del potencial de esta técnica en el mundo del vino. Tanto potencial que la compañía Bruker ya comercializa un equipo especifico para el vino, el WineScreener. ¡Es el futuro!!! 

Este post participa en el XXVII Carnaval de Química, que se aloja en el blog Educación Química de Bernardo Herradón @QuimicaSociedad


Posted on domingo, septiembre 15, 2013 by Héctor Busto

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09 septiembre 2013

La Resonancia Magnética Nuclear (RMN) en los últimos años se está convirtiendo en una herramienta totalmente multidisciplinar, más allá de sus primeros usos en los laboratorios de Química Sintética de todo el mundo. En el primer post de este blog ya hablé del empleo de la RMN en el mundo de la Enología y el seguimiento de diferentes compuestos de interés en los procesos de fermentación del vino. Sí todo va bien, este post tendrá sus extensiones. Pero ahora me quiero centrar en el empleo de la RMN en otro campo bien diferente. El de la Medicina. Diréis, -anda, que descubre éste, pero si la Resonancia Magnética ha sido y es empleada diariamente en medicina-. Efectivamente, la Resonancia Magnética de Imagen. La que permite, en función del tipo de tejido que se observa, obtener imágenes de una cada vez más perfecta resolución, de por ejemplo, una lesión de rodilla.

Equipo de RMN de la Universidad de La Rioja.


Pero en este caso me estoy refiriendo a la espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear, que no nos ofrece una imagen, sino un espectro de señales difícil de interpretar, a priori, para un profano y que se relacionan con diferentes compuestos. La naciente disciplina científica que es la metabolómica hace uso, entre otras herramientas, de la RMN. Cada ser vivo es una fabrica de multitud de compuestos químicos. Como estos compuestos se producen en rutas metabólicas (conjunto de reacciones químicas que se producen en un ser vivo) los denominamos metabolitos. Cualquier pequeña variación en la concentración de esos metabolitos en un determinado ser vivo puede deberse a una disfunción y por tanto a una enfermedad del mismo. De ahí la importancia de la RMN en metabolómica para poder detectar estos compuestos y sus variaciones de concentración en sencillos experimentos. Así se podría llegar, por ejemplo, a diagnosticar con suficiente tiempo una determinada enfermedad.

Bien, pues las bacterias como por ejemplo las Escherichia Coli, también generan sus metabolitos cuando están en un medio de cultivo. Con estas premisas, y con nuestra experiencia en el seguimiento de diferentes procesos en el vino mediante RMN, a iniciativa del grupo de Enfermedades Infecciosas del Doctor José Antonio Oteo del CIBIR, nos pusimos a trabajar en la posibilidad de medir la actividad antimicrobiana de diversos antibióticos.

Teníamos que ser capaces de medir la cantidad mínima de antibiótico que conseguía parar o inhibir la actividad de la bacteria correspondiente. Para ello en el CIBIR se realizaron los cultivos convenientes con las dosis de antibiótico precisas para el estudio y se prepararon para introducir el medio en la RMN. Está técnica necesita poca cantidad de muestra, unos 0.6 mL y además, y es una de las cosas más importantes, no destruye la misma.

Las muestras preparadas e introducidas en unos tubos específicos para la RMN se llevaron a los laboratorios de RMN de la Universidad de La Rioja. Trabajando con muestras sin antibiótico se observa claramente diversos metabolitos que son producidos por la actividad de la bacteria. Uno de los más característicos es el etanol.  Estas señales se ven muy fácilmente por RMN tal y como muestro en la figura. También se detectan fácilmente el ácido acético y el ácido succínico. El tiempo del experimento optimizado puede durar no más de dos minutos. Posteriormente se realizan los experimentos con las muestras tratadas con diversas cantidades de antibiótico. Cuando la cantidad de antibiótico es suficiente para inhibir la actividad de la bacteria, los metabolitos que antes se generaban ahora no aparecen. Ya no se ve la señal de etanol. Así de fácil.

Espectros de cultivos bacterianos con diferentes cantidades de antibiótico. Fuente propia.


Atendiendo al humor gráfico del excelente Tris (periodista gráfico del Diario La Rioja) podíamos decir que las lagrimas que detectamos al poner la película Bambi a las bacterias son de etanol. También hay otros compuestos que utilizamos como marcadores pero al revés, son consumidos por las bacterias y cuando éstas están en presencia de la suficiente cantidad de antibiótico no se generan al estar inhibido su crecimiento. Entre estos compuestos está el aminoácido treonina.

Humor gráfico de Tris publicado en Diario La Rioja



Estos estudios han dado lugar de momento a una patente recientemente concedida y a un artículo en la revista internacional Future Microbiology. Tiene que ser un orgullo para el Gobierno de La Rioja que dos instituciones públicas de investigación como son el CIBIR y la Universidad de La Rioja sustentadas con fondos públicos colaboren y logren estos resultados. Así se tiene que ver para el beneficio de la sociedad riojana. Por último me he atrevido a realizar una modificación de la viñeta de Tris para hacerla un poco más realista ;-)

Humor gráfico de Tris con el logo de la otra institución partícipe del estudio.
Este post participa en el XXVII Carnaval de Química, que se aloja en el blog Educación Química de Bernardo Herradón @QuimicaSociedad 

Posted on lunes, septiembre 09, 2013 by Héctor Busto

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